摘要：马铃薯晚疫病（late blight）是由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯生产中最具毁灭性的病害，明确晚疫病菌的交配型及对甲霜灵敏感性状况对制定马铃薯晚疫病防治策略具有重要意义。本研究对2011—2013年采自黑龙江省黑河、齐齐哈尔、绥化等马铃薯主产区的晚疫病菌菌株进行交配型及对甲霜灵敏感性测定，采用对峙培养法对153株晚疫病菌进行交配型检测，结果表明，A1交配型79株，占51.63%，A2交配型74株，占48.37%；采用菌落直径法对143株晚疫病菌进行甲霜灵敏感性测定，结果表明，83.92%表现高抗，8.39%表现中抗，7.69%表现敏感。
关键词：马铃薯；晚疫病菌；交配型；甲霜灵
中图分类号：S 435.32文献标识码：ADOI：10.3969/j.issn.05291542.2016.01.033Mating type and metalaxyl sensitivity test of Phytophthora
infestans in Heilongjiang ProvinceWang Teng1，Min Fanxiang2，Guo Mei2，Yang Shuai2，Gao Yunfei2，Jin Guanghui1，Ma Shuang1（1. Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing163319， China； 2. Institute of Plant Virusfree
Seedlings， Heilongjiang Provincial Academy of Agricultural Sciences， Harbin150086， China）AbstractPotato late blight caused by Phytophthora infestans is the most devastating disease in potato production. It is of great importance to clear the mating type of P.infestans and metalaxyl sensitivity for prevention and control of potato late blight. In this study， we measured the mating type and metalaxyl sensitivity of P.infestans strains collected from Heihe， Qiqihar， Suihua and other main potato producing area in Heilongjiang Province during 2011-2013.Mating type determination by dual culture method demonstrated that， among 153 strains， 79 strains were A1 mating type， accounting for 51.63%； 74 strains were A2 mating type， accounting for 48.37%. Metalaxyl sensitivity test by colony diameter method showed that 83.92% were highly resistant among all the 143 tested strains， 8.39% were moderate resistant and 7.69% were sensitive.
Key wordspotato；Phytophthora infestans；mating type；metalaxyl馬铃薯晚疫病（late blight）是由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的马铃薯生产中最具毁灭性的病害，目前在我国各地均有发生[1]，尤其在我国中部和北部发生较普遍。在我国因晚疫病引起的产量损失每年平均达到10亿美元左右[2]。
晚疫病存在A1、A2两种交配型，两者可通过异宗配合进行有性生殖产生卵孢子。卵孢子的抗逆性及适应力更强，能在土壤中越冬，成为次年的初侵染源，而且在有性生殖的过程中会发生基因重组，导致生理小种变异加快，生理小种组成会日趋复杂。在我国，1996年张志铭等[3]首次报道了在内蒙古发现A2交配型，之后在我国各马铃薯主产区陆续报道了A2交配型的存在[47]。黑龙江省自2004年以来，朱小琼等[8]、金光辉等[910]、张铉哲与徐生军[11]、闵凡祥等[12]先后对黑龙江省马铃薯晚疫病菌进行了交配型的研究，均未发现黑龙江省马铃薯晚疫病菌存在A2交配型。
甲霜灵（metalaxyl）为苯基酰胺类杀菌剂，是防治晚疫病的有效药剂之一，于 1977 年在生产上推广应用，该类药剂对马铃薯晚疫病有很好防效，具有保护兼治疗的作用[13]。但其连续施用多年后， 病原菌即产生抗药性[14]。在国内李炜等[15]最先报道了1994 年采自河北、黑龙江、内蒙古、甘肃等地的马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的抗性情况，随后朱杰华[16]、杨志辉等[17]、袁善奎等[18]、孙秀梅等[19]、徐生军等[20]、王文桥等[21]先后进行了黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵类药剂敏感性的研究，所有研究结果均表明在黑龙江省甲霜灵高抗菌株已普遍存在。
本研究在前人研究基础上继续对黑龙江省晚疫病菌的交配型及甲霜灵敏感性进行检测研究，以明确黑龙江省晚疫病的交配型及对甲霜灵敏感性状况，为今后晚疫病防治提供理论依据。
42卷第1期王腾等：黑龙江省马铃薯晚疫病菌交配型及对甲霜灵敏感性测定20161材料及方法
1.1供试材料
供试菌株为2011—2013年采自黑龙江省黑河、绥化、齐齐哈尔等马铃薯主产区的晚疫病菌株，经分离纯化后保存在黑麦培养基斜面上。A1 交配型标准菌株来自北京，A2 交配型标准菌株来自荷兰，均由中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供。药剂为98%甲霜灵原药，由先正达公司生产。
1.2试验方法
1.2.1交配型测定
采用对峙培养技术鉴定各菌株的交配型。将标准菌株和待测菌株分别预培养，然后取待测菌株的菌丝块单独培养，并分别与A2、A1标准菌株对峙培养，菌丝块之间距离1.5 cm；每个菌株3次重复（图1a）。在18℃黑暗条件下培养2周后，在显微镜下观察各待测菌株单独培养的菌落及与标准菌株对峙培养的菌落交界处是否产生卵孢子（图1b）。若单独培养和与A2配对时不产生卵孢子，与A1配对时产生卵孢子，说明该菌株为A2交配型；反之，则为A1交配型；若待测菌株与两个标准菌株对峙培养时均有卵孢子产生，且单独培养也能产生卵孢子，说明该菌株自交可育。
1.2.2甲霜灵敏感性测定
采用菌落直径法。将98%的甲霜灵原药用灭菌的二甲基亚砜稀释成母液，取定量的母液与定量的黑麦培养基混匀，使培养基含甲霜灵质量浓度为0.0、5.0、100 μg/mL。将培养基迅速倒入培养皿（d=90 mm）中，对照中加入等量的二甲基亚砜，每个处理3个重复。待培养基凝固后在每个培养皿中接种直径为5 mm的菌盘。18℃黑暗培养8～10 d，待对照菌落直径至少为50 mm时，采用十字交叉法测量菌落直径，根据含药平板菌落直径与空白对照平板菌落直径的比值测定待测菌株的甲霜灵敏感性（图2）。
图1马铃薯晚疫病菌交配型测定
Fig.1Mating type determination of Phytophthora infestans图2马铃薯晚疫病菌对甲霜灵敏感性测定
Fig.2Metalaxyl sensitivity test of Phytophthora infestans
参照Oyarzun 等[22]的方法，根据菌落直径划分晚疫病菌对甲霜灵的敏感性和抗性等級。具体划分标准如下：
敏感：d5/dck≤0.4；中抗：d100/dck≤0.4
dck：CK菌落直径；d5：含药5 μg/mL培养基中培养菌的菌落直径；d100：含药100 μg/mL培养基中培养菌的菌落直径。
2结果与分析
2.1交配型的测定
对2011—2013年采集的153株马铃薯晚疫病菌菌株进行交配型的测定，结果（表1）显示： 153株晚疫病菌中A1交配型79株，占总菌株数的51.63%，A2交配型74株，占总菌株数的48.37%。未发现自育型及其他类型菌株。由各地区交配型总体情况看，各地区均发现有A2交配型。说明A1交配型已不是优势病菌群体。由年际间A2交配型情况看，2011年A2交配型占25.93%，2012年A2交配型占79.31%，2013年A2交配型占34.15%；A2交配型所占比例在3年间呈现由少变多又变少的现象。同样，黑河、齐齐哈尔、绥化3地A2交配型在3年间所占比例也均出现此现象。表12011-2013年黑龙江不同地区马铃薯晚疫病菌交配型
Table 1Mating type of Phytophthora infestans in different regions of Heilongjiang Province in 2011-2013年份
Year地区
City总株数/株
Total numberA1株数/株Number百分率/%PercentageA2株数/株Number百分率/%Percentage2011黑河Heihe8675.00225.00齐齐哈尔 Qiqihar201995.0015.00绥化Suihua261557.691142.31小计Total544074.071425.932012黑河Heihe400.004100.00齐齐哈尔 Qiqihar21628.571571.43绥化Suihua33618.182781.82小计Total581220.694679.312013黑河Heihe15320.001280.00齐齐哈尔 Qiqihar151386.67213.33绥化Suihua1111100.0000.00小计Total412765.851434.15合计Total1537951.637448.37
2.2对甲霜灵敏感性测定
对2011—2013年采集的143株马铃薯晚疫病菌菌株进行甲霜灵敏感性测定结果表明： 143株晚疫病菌菌株中，83.92%表现高抗，8.39%表现中抗，7.69%表现敏感。总体来看，2011年敏感菌株占13.43%，抗性菌株占86.57%，2012年敏感菌株占5.56%，抗性菌株占94.44%，2013年未发现敏感菌株，抗性菌株占100%；晚疫病菌在3年内对甲霜灵敏感性表现为敏感菌株逐渐减少，抗性菌株不断增多的现象；但各地区晚疫病菌在3年内对甲霜灵敏感性表现并不相同，说明各地区间施药习惯存在差异。表22011-2013年黑龙江省不同地区马铃薯晚疫病菌对甲霜灵的敏感性
Table 2Sensitivity of Phytophthora infestans to metalaxyl in different regions of Heilongjiang Province in 2011-2013年份
Year地区
City总株数/株
Total
number株数/株Number敏感
Sensitivity中抗
Moderate
resistance高抗
High
resistance百分率/%Percentage敏感
Sensitivity中抗
Moderate
resistance高抗
High
resistance2011黑河Heihe910811.110.0088.89齐齐哈尔Qiqihar1600160.000.00100.00绥化Suihua42803419.050.0080.95小计Total67905813.430.0086.572012黑河Heihe20020.000.00100.00齐齐哈尔Qiqihar1120918.180.0081.82绥化Suihua2304190.0017.3982.61小计Total3624305.5611.1183.332013黑河Heihe1606100.0037.5062.50齐齐哈尔Qiqihar1302110.0015.3884.62绥化Suihua1100110.000.00100.00小计Total4008320.0020.0080.00合计Total14311121207.698.3983.92
3结论与讨论
自1996年张志铭等[3]首次报道了在我国内蒙古发现A2交配型后，黑龙江省学者也对晚疫病菌交配型进行了多次报道。2004年，朱小琼等[8]测定了2000-2002年采自四川、重庆、吉林、黑龙江、福建、北京6省市的74株马铃薯晚疫病菌的交配型，其中黑龙江未发现A2交配型；2006年，金光辉等[9]测定黑龙江省8个市县的109个菌株的晚疫病菌交配型，结果表明109个菌株均为A1交配型，未发现A2交配型；2010年，张铉哲与徐生军[11] 检测黑龙江与吉林晚疫病菌交配型，结果显示黑龙江地区未发现A2交配型；2010年，闵凡祥等[12]对2004-2009年采集的124株晚疫病菌进行交配型测定，未发现A2交配型。这些报道显示2010年之前黑龙江省未发现A2交配型，但金光辉通过对晚疫病生理小种的研究推测克山县可能存在A2交配型[10]；本研究首次证实了在黑龙江省各马铃薯主产区均已存在A2交配型。
有关黑龙江省晚疫病菌对甲霜灵敏感性研究开展较早，甲霜灵高抗菌株在黑龙江省已普遍存在[1521]，但各地区间因施药习惯不同，抗性菌株出现频率存在差异；本研究对2011—2013年晚疫病菌总体研究表明，2013年黑龙江省晚疫病菌对甲霜灵具有抗药性的菌株出现频率自北向南呈逐步增加的趋势，这与孙秀梅等[19]2009年的研究结果一致，但2011年与2012年的晚疫病菌并未出现此种趋势，年际间晚疫病菌抗药性频率存在差异。
本研究通过对黑龙江省马铃薯晚疫病菌交配型研究发现，黑龙江省黑河、齐齐哈尔、绥化等地区均已发现A2交配型，A1交配型已不是优势病菌群体。今后工作重点应是加强马铃薯抗晚疫病育种的研究，尽快筛选出对晚疫病菌具有持久水平抗性的材料。这样即使出现了A2 交配型， 也不至于因为生理小种的变异而造成品种抗性的快速丧失。通过对黑龙江省马铃薯晚疫病菌对甲霜灵敏感性的测定发现，黑龙江省黑河、齐齐哈尔、绥化等地区的晚疫病甲霜灵抗性菌株均在80%以上，且呈现逐年增加的现象。因此今后不宜继续使用苯基酰胺类杀菌剂防治马铃薯晚疫病，应改用其他类型杀菌剂，并注意不同类型杀菌剂交替及混合使用，避免使用单一杀菌剂产生抗药性。
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（责任编辑：王音）