对照组降低（P<0.05或P<0.01），β-catenin蛋白水平较对照组升高（P<0.01），膈下逐瘀汤低剂量组sFRP4，Axin1，Axin2基因转录水平较模型组升高（P<0.05或P<0.01），β-catenin蛋白水平较模型组降低（P<0.01）。结论：上调β-catenin蛋白水平、下调Wnt通路抑制因子转录水平从而增强Wnt通路活性是MBNA致大鼠食管癌前病变的可能分子机制之一，膈下逐瘀汤虽可下调β-catenin蛋白水平、上调Wnt通路抑制因子转录水平，但不足以阻断MBNA诱发的食管癌前病变。
[关键词] 甲基苄基亚硝胺；食管癌；膈下逐瘀汤；大鼠；β-catenin；sFRP；Axin；GSK-3β
亚硝胺类化合物是常见化学致癌物之一，约有10余种亚硝胺与食管癌的发病有关，如甲基苄基亚硝胺（MBNA）、甲基戊基亚硝胺等。Wnt/β-catenin信号通路是调控细胞生长、发育和分化的重要途径，与多种人类肿瘤的发生、浸润和转移密切相关[1]。已有研究证实，在人类食管癌的发生过程中也存在Wnt/β-catenin通路的激活[2-3]。
中医认为“气塞不通，血壅不流”与癌瘤的发生有关，气滞日久必血瘀不畅，气滞血瘀，渐成瘤块，久积为癌，因此理气活血类方剂如膈下逐瘀汤广泛应用于恶性肿瘤防治的中医临床实践[4-5]。为探讨亚硝胺致食管癌变与Wnt通路的关系及理气活血类方剂对该通路的影响，本研究以MBNA为诱变剂建立大鼠食管癌前病变模型，并于诱变期间予以膈下逐瘀汤干预，检测了食管组织β-catenin蛋白的表达变化及Wnt通路抑制因子sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β的基因转录水平变化，为人类食管癌的发病机制提供参数，并为食管癌的中医药防治研究提供基础资料。
1 材料
1.1 动物 雄性Wistar大鼠，清洁级，购自上海斯莱克实验动物有限公司，体重180～200 g，生产许可证号SCXK（沪）2012-0002，合格证号2007000541047。
1.2 药物与试剂 MBNA（本实验室有机合成）；RNA guard（上海华舜生物技术有限公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR Premix Ex Taq（大连宝生物工程有限公司）；兔抗β-catenin多克隆抗体（美国Cell Signaling公司）；兔抗GAPDH多克隆抗体（杭州贤至生物科技有限公司）；山羊抗兔IgG抗体、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；引物由上海生工生物工程有限公司合成。膈下逐瘀汤全成分颗粒剂由福建省人民医院中药房提供，处方为：醋五灵脂6 g、当归9 g、川芎6 g、桃仁9 g、牡丹皮6 g、赤芍6 g、乌药6 g、醋延胡索3 g、甘草9 g、醋香附6 g、红花9 g、炒枳壳5 g，处方编号21095649。
1.3 仪器 SDS-PAGE电泳仪、转膜仪（美国BIO-RAD公司）；荧光定量PCR仪（德国Eppendorf公司）。
2 方法
2.1 分组与给药 Wistar大鼠按体重分层随机分为模型组、膈下逐瘀汤高、低剂量组及正常对照组，每组8只。除对照组，其余各组参考文献方法[6]，以MBNA 3.5 mg·kg-1体重剂量，每周2次颈背部皮下注射，连续注射10周。对照组颈背部皮下注射等体积氯化钠注射液。于诱变首日开始，膈下逐瘀汤高、低剂量组分别以膈下逐瘀汤16，8 g·kg-1剂量（以全方生药量计）灌胃给药，模型组和对照组以等体积蒸馏水灌胃，每日1次，共10周。根据实验动物等效临床剂量换算，膈下逐瘀汤给药剂量相当于成人日剂量的2，1倍。
2.2 病理学检查 实验结束时处死大鼠，沿食管纵行剖开，于解剖镜下观察食管黏膜病变情况，拍照记录。取典型病变组织用10%中性福尔马林固定液固定，常规制片，HE染色，光镜观察病理组织学变化。余下食管组织分为2份，保存于RNA guard及液氮中，分别用于提取食管组织总RNA及总蛋白。
2.3 基因转录水平检测 sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β基因转录水平检测采用Real-time RT-PCR法。用Trizol法提取食管组织总RNA，核酸蛋白分析仪检测A260/A280，计算RNA浓度；琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。使用RevertAid First Strand cDNA synthesis kit试剂盒将总RNA中的mRNA逆转录为cDNA，再以cDNA为模板进行荧光实时定量PCR检测（SYBR染料法）。扩增条件为：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。反应结束后确认扩增曲线和熔解曲线，以β-actin为内参基因，用2-ΔΔCt值表示目的基因转录水平。各基因引物及扩增产物片段长度见表1。
2.4 β-catenin 蛋白水平检测 采用Western blot法检测食管组织β-catenin蛋白水平。组织裂解后提取总蛋白，BCA法进行蛋白定量，各组取等量蛋白经SDS-PAGE（分离胶10%，浓缩胶3%）分离后，转移到PVDF膜上；TBST脱脂奶粉封闭液（5%脱脂奶粉）室温封闭2 h，兔多克隆β-catenin抗体（1∶500）和兔多克隆GAPDH抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，再与山羊抗兔IgG 抗体（1∶2 000）37 ℃孵育1 h，ECL法压片曝光，使用Gel-Pro Analyzer 4.0软件分析各组食管组织β-catenin蛋白水平。
2.5 统计分析 数据均采用±s表示，用SPSS 13.0统计软件进行分析，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较采用最小显著性差异法（LSD法）。
3 结果
3.1 一般情况观察 对照组大鼠体重增长较迅速。其余各组大鼠在诱变初始2周内体重略有减轻，至第3周开始体重缓慢增加，随着MBNA暴露次数和累积剂量的增加，体重增速逐渐变慢，体重较对照组显著降低（P<0.01）。膈下逐瘀汤高、低剂量组与模型组比较体重的变化基本一致。实验过程中，对照组大鼠皮毛柔顺，有光泽，对外界刺激反应较灵敏，其余各组大鼠逐渐出现活动减少，食量下降，耸毛，毛色无光泽、易脱落，对外界刺激反应较迟钝等现象。
3.2 食管病理形态学及病理组织学变化 对照组大鼠食管黏膜光滑平整，未见明显异常。模型组、膈下逐瘀汤高、低剂量组大鼠食管黏膜均出现全段病变，食管腔内可见食物残渣，食管黏膜粗糙，出现乳突瘤样改变，成瘤率为100%。膈下逐瘀汤高、低剂量组食管黏膜的病变程度与模型组比较未见明显改善，见图1。病理组织学显示，对照组大鼠食管黏膜上皮细胞1～3层，细胞排列均匀，基底细胞层规整，未见异常改变；膈下逐瘀汤高、低剂量组病理组织学检查结果与模型组无明显差异，均表现为上皮细胞明显增生，层次增多，细胞排列紊乱，细胞向管腔方向增生形成乳头状突起，见图2。
3.3 Wnt通路抑制因子基因转录水平 MBNA诱变10周时，模型组大鼠食管组织sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2基因转录水平较对照组降低（P<0.05或P<0.01）；GSK-3β基因转录水平与对照组比较在数值上有所减小，但尚无统计学意义。MBNA诱变期间同时给予等效人临床1倍剂量膈下逐瘀汤干预，sFRP4，Axin1，Axin2基因转录水平较模型组升高（P<0.05或P<0.01）；MBNA诱变期间同时给予等效人临床2倍剂量膈下逐瘀汤干预，各基因的转录水平与模型组比较无明显差异，见图3。
3.4 食管组织β-catenin蛋白水平 经MBNA诱变10周，模型组大鼠食管组织β-catenin蛋白水平较对照组升高；膈下逐瘀汤低剂量干预后，大鼠食管组织β-catenin蛋白水平较模型组降低；膈下逐瘀汤高剂量干预后，大鼠食管组织β-catenin蛋白水平与模型组比较无明显变化，见图4。
4 讨论
亚硝胺类化合物是国际公认的强致癌污染物之一，通常被认为是腌制食品、烟草等致癌性的主要物质基础。其中，MBNA是一种前致突变物，经体内代谢产生的活性代谢产物具有较强的致突变作用，实验研究证实MBNA可诱发多种动物食管癌以及人食管上皮鳞癌[6-9]。MBNA诱发食管癌变存在着复杂的分子机制，迄今为止尚未被完全揭示。MBNA诱发的大鼠食管乳头状瘤存在ras癌基因的突变激活[7]；MBNA可引起大鼠食管凋亡抑制基因Survivin的激活[6]；MBNA的诱变可引起大鼠食管组织2 261个基因的表达改变[8]，可见MBNA诱导食管癌变与多种癌基因及抑癌基因调控活性改变有关。由于信号转导通路内部及不同信号转导通路之间存在着复杂的网络调节，通常需要多种因素共同作用才会引发肿瘤，因此在食管癌发病机制研究中不能过分强调某一基因的改变。目前研究表明，Ras/MAPK通路，Wnt/β-catenin，NF-κB通路的激活与食管癌的发生有关[10]。
本研究结果显示，经MBNA诱变10周，在大鼠食管组织中可检测到Wnt通路关键分子β-catenin蛋白水平的升高。王丽芳等报道MBNA诱变F344大鼠5周，诱变开始后第9周食管组织β-catenin蛋白水平是同期正常大鼠的4倍左右[11]。针对Wistar大鼠的研究仅检测到约1.5倍左右的β-catenin蛋白水平上调，笔者推测可能与实验大鼠品种及MBNA诱变方式的差异有关。
本研究针对Wnt通路抑制因子sFRP1，sFRP4，Axin1，Axin2，GSK-3β基因转录水平的检测表明，经MBNA诱变10周时，除GSK-3β基因转录水平的降低尚无统计学意义外，其余各抑制因子的基因转录水平均较正常组显著降低。sFRP1，sFRP4属于Wnt信号通路分泌型抑制因子，其在细胞外与Wnt分子竞争性结合Frizzled受体而发挥拮抗Wnt信号通路的作用。在人类食管癌的研究中发现sFRP1，sFRP4在食管鳞状细胞癌中的表达水平显著低于癌旁正常组织[12]。Wnt通路的活性也受到细胞内型抑制因子的调节，包括APC，Axin，GSK-3β等，细胞内型抑制因子参与组成β-catenin的降解复合物，该复合物的功能是使胞浆内的β-catenin发生磷酸化从而被泛素化降解。β-catenin降解复合物形成障碍是Wnt通路活性升高的原因之一。本研究结果提示，下调上述Wnt通路抑制因子转录水平从而增强Wnt通路活性是MBNA致大鼠食管癌前病变的可能分子机制之一。
膈下逐瘀汤出自清代《医林改错》，具有活血化瘀，行气止痛之功效，在恶性肿瘤的中医临床实践中，以该方加减可治疗肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌及各种晚期癌性疼痛。本研究结果显示，等效人临床1，2倍剂量膈下逐瘀汤于诱变期间干预大鼠，对MBNA诱导的大鼠食管癌前病变并无明显阻断作用。但针对β-catenin蛋白水平及Wnt通路相关抑制因子的检测则显示，等效人临床1倍剂量膈下逐瘀汤可对MBNA诱变所致的Wnt通路抑制因子sFRP4，Axin1，Axin2转录水平的下调有不同程度的升高作用，可抑制β-catenin蛋白水平的上调，等效人临床2倍剂量膈下逐瘀汤却未能体现上述作用。这一现象笔者认为主要与以下几个方面有关。首先，癌变过程是一个多信号通路多基因调控活性改变的复杂过程，MBNA诱导的大鼠食管癌变涉及Wnt通路活性的上调，但并不依赖也不局限于该通路活性的改变；其次，中药方剂由多味中药配伍而成，每味中药又含有数种不同的化学成分，不同的化学成分可作用于不同的靶点，因此方剂的量效关系表现较为复杂，不同剂量水平下可表现出相似的或者截然不同的效应；再次，中医学认为食管癌是由内伤饮食、情志、脏腑功能失调3种因素相互影响共同致病，在不同阶段可表现为热毒、气滞、血瘀、痰凝，气滞多见于早中期食管癌，而血瘀则可见于各期食管癌。MBNA诱变后的大鼠表现为毛发枯槁不泽、形体消瘦，具有热毒伤阴的特征，因此仅以理气活血法干预不足以阻断MBNA诱发的食管癌前病变。
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